“Перфторан”: революционная комбинация

Рефераты по биологии и химии » “Перфторан”: революционная комбинация

Андрей Артурович Недоспасов д.х.н. Наталия Владимировна Беда м.н.с. Институт молекулярной генетики РАН

“Нет ничего более практичного чем хорошая теория” - фундаментальная наука неизбежно находит выход в практику. Увы в родном отечестве эта аксиома все чаще оказывается теоремой проблемой а то и просто иллюзией. Быть может фундаментальные исследования описанные в этой работе позволят восстановить статус-кво и минимизировать ущерб от возникшего дисбаланса.

Многие лекарственные препараты и методы лечения открытые задолго до “эры NO” в большей или меньшей степени влияют на метаболизм оксидов азота но действие это часто остается незамеченным а лечебные эффекты объясняются какими-то другими причинами. Яркий пример тому - клиническое применение искусственных кровезаменителей на основе перфторорганических соединений (ПФС) известных в России под названиями “Голубая кровь” и “Перфторан” [1-3].

Идея ПФС-кровезаменителей возникла в конце 60-х годов XX в. Поскольку жидкие ПФС прекрасно растворяют кислород эмульсии из них могли бы выполнять газотранспортную функцию эритроцитов крови. Исследования активно велись в Японии СССР и США. В 80-е годы во время афганской войны опытные партии советских препаратов спасли немало жизней раненым обреченным на неминуемую смерть от потери крови. В настоящее время “Перфторан” допущен к клиническому применению и свободно продается в аптеках.

Со временем выяснилось что применение “Перфторана” в том числе в малых дозах часто дает положительные эффекты для которых связь с его газотранспортной функцией не просматривается. Одновременно обнаружили ряд побочных эффектов также не находивших объяснения. Сегодня многие из них стали понятны благодаря представлениям о мицеллярном окислительном нитрозировании *. Этот термин предложенный нами для введения радикала ·NO в гетерогенной среде подразумевает что в значительной степени реакции идут по радикальному механизму: молекула NO реагирует со свободным радикалом образовавшимся из молекулы-мишени под действием ·NO2 - продукта окисления NO.

* Подробнее см.: Недоспасов А.А. Беда Н.В. Биогенные оксиды азота // Природа. 2005. №7. С.33-39.

Перфторуглеводороды (ПФУ) - экстремально гидрофобные вещества с большим коэффициентом распределения Q для кислорода и NO в смесях с водой. Кислород растворяется в них (в гидрофобной фазе эмульсии) гораздо лучше чем в воде или плазме крови из-за чего они и нашли применение в составе кровезаменителей. Благодаря мицеллярному катализу микрокапли эмульсии в крови действуют как губки для обоих газов именно в них происходит теперь основная часть окисления NO.

В предыдущей статье мы рассматривали влияние гидрофобных фаз на процессы окисления NO (например при образовании холестериновых бляшек на стенке кровеносного сосуда). При сравнении с эмульсией ПФС-кровезаменителей заметны три существенных отличия.

Во-первых гораздо выше значения Q. Поскольку ускорение реакции окисления NO при введении оптимальных количеств гидрофобной фазы пропорционально QNO в присутствии “Перфторана” окисляется гораздо быстрее [4 5]. При этом увеличиваются скорости нитрозирования и других процессов зависимых от мицеллярного катализа - все они протекают преимущественно в искусственной гидрофобной фазе или на границе раздела фаз. Концентрация NO в водной фазе первоначально падает что приводит к активации ферментов NO-синтаз поставляющих NO.

Во-вторых капли эмульсии не смачивают стенки сосудов (перфторуглеводороды вообще ничего не смачивают из имеющихся в организме поверхностей раздела фаз). Более того NO из холестериновых бляшек и других “обычных” гидрофобных фаз также частично переходит в капли эмульсии. Значит повреждающее действие продуктов окисления NO на стенки сосудов уменьшается.

В-третьих линейные размеры капель эмульсии в “Перфторане” менее 0.1 мкм (диаметр эритроцита ~20 мкм а холестериновой бляшки много больше); соответственно отношение поверхности к объему оптимально для протекания реакций нитрозирования на границе раздела. Если в окружающем пространстве присутствуют тиолы (RSH) капля эмульсии может действовать как миниатюрный реактор по производству тионитритов (RSNO). В норме в плазме крови довольно высокая концентрация восстановленного глутатиона (трипептида содержащего остаток цистеина со свободной HS-группой) нитрозоформа которого - прекрасный донор NO.

Таким образом аналогия капли перфторуглеводородной эмульсии с эритроцитом оказалась гораздо глубже чем полагали сначала: оба переносят и кислород и углекислый газ и NO/RSNO. Понятно что даже малые дозы кровезаменителей типа “Перфторана” введенные в кровяное русло обладают эффектом характерным для нитроглицерина (основы динамита и одновременно популярного лекарства) т.е. вызывают релаксацию сосудов и восстанавливают кровообращение.

В первых опытах на крысах было наглядно продемонстрировано влияние эмульсий перфторуглеводородов на метаболизм NO: при введении “Перфторана” наблюдались предсказанные колебания концентраций нитрита и нитрата в плазме изменения частоты сердечных сокращений обычные при действии вазодилаторов типа нитроглицерина. Ингибирование NO-синтаз снимало эти эффекты [6]. Несколько лет спустя эту работу повторили в США [7].

Побочные эффекты применения кровезаменителей типа “Перфторан” во многих случаях проявлялись не сразу а спустя значительное время после переливания крови. Поверхностно-активные вещества используемые для стабилизации эмульсий при создании ПФУ-кровезаменителей выводятся из организма гораздо быстрее чем сами ПФУ (характерные времена - сутки и месяц соответственно). Если в первые часы после введения эмульсия становится основным местом окисления NO то через сутки процессы перемещаются главным образом в естественные липидные фазы организма в которых растворились ПФУ. Ясно что в организме они (в виде отдельной фазы или растворенные в имеющихся гидрофобных фазах) будут влиять не только на параметры мицеллярного окисления NO из-за роста QO2 и особенно QNO но и на все последующие процессы включая нитрование и нитрозирование липидов белков и нуклеиновых кислот. Таким образом “отравления” под действием химически инертных перфторуглеводородов в том числе газообразных растворяющихся в липидах можно объяснить потерей устойчивости системы регуляции метаболизма оксидов азота.

Рис.1. Схема биосинтеза NO и основные метаболические пути оксидов азота.

Ускорение окисления NO кислородом отражается на равновесии высших оксидов азота; при этом их стационарные концентрации меняются. Если электрофильное нитрозилирование (образование RSNO рис.1) преимущественно протекает под действием NO+ (N2O3 N2O4) а радикальные реакции (включая нитрование и окисление белков и нуклеиновых кислот) - под действием ·NO2 то при использовании искусственных гидрофобных фаз в качестве кровезаменителей желательно сместить равновесие в сторону первых во всяком случае не увеличивать стационарные концентрации NO2.

Концентрации высших оксидов азота при окислении NO чрезвычайно низки и измерить их обычными методами не удается. Мы нашли простой и чувствительный способ основанный на определении нитрата в продуктах окисления. Нитрат восстанавливается в нитрит соединениями ванадия скорость этого процесса измеряют с помощью реакции Грисса (по образованию красителя). Если из образца удалить имевшийся первоначально (до восстановления нитрата) нитрит весь образовавшийся краситель будет происходить из нитрата. Поскольку в результате гидролиза N2O3 получается только нитрит

N2O3 + H2O = 2HNO2 (1)

а при гидролизе N2O4 - эквимолярная смесь нитрита и нитрата

N2O4 + H2O = HNO2 + HNO3 (2)

доля нитрата в продуктах будет мерой стационарных концентраций обоих оксидов. В целом в малополярных гидрофобных фазах стабилизация N2O3 при сольватации минимальна распад на NO и NO2 усиливается и доля NO2 должна расти:

NO2 + NO = N2O3. (3)

Анализ системы уравнений для стационарных концентраций оксидов азота показал что возможно снижение [NO2]ст независимо от изменений [NO]ст и общего пула оксидов азота [8]. В частности избирательно ускоряя нитрозилирование мы снижаем не только [N2O3]ст но и [NO2]ст т.е. скорости всех радикальных реакций с его участием. В этой связи поиск катализаторов нитрозилирования/денитрозилирования становится важной задачей биохимии.

Рис.2. Гистограмма отражающая вклад гетерогенности среды и катализаторов денитрозирования в баланс нитрит/нитрат при окислении NO. Слева: в гетерогенной среде скорость окисления NO выше чем в гомогенной. Обычно система равновесий высших оксидов азота сдвигается в сторону NO2 и N2O4 и доля нитрата в продуктах возрастает. Triton X 100 - детергент (аналог мыла) использованный для получения липосом (по данным Liu et al. 1998). Справа: хотя в CF-эмульсиях скорость окисления NO возрастает сильнее чем в обычных липидах сольватация и скорости гидролиза высших оксидов азота изменены. В присутствии “Перфторана” доля нитрата в продуктах ниже чем в гомогенном водном растворе (левая пара столбиков). Фосфат (PO4– 3 ) пиро- (P2O7–4 ) и триполифосфат (P3O10–5 ) ускоряют гидролиз N2O3 в нитрит. В результате стационарные концентрации NO2 и N2O4 уменьшаются и выход нитрата падает. Видно что полифосфат гораздо активнее чем фосфат. Hepes - компонент буферного раствора.

Сравним влияние гетерогенности среды и сольватации на нитрит-нитратный баланс в продуктах окисления NO в присутствии обычных липидов и в “Перфторане” (рис.2). Видно что в первом случае при добавлении гидрофобной фазы доля нитрата (а значит вызываемых ·NO2 радикальных реакций!) растет во втором оказывается ниже чем в гомогенном водном растворе [9]. Отчасти эффект связан с каталитическим действием полиэфирного стабилизатора эмульсии на реакцию нитрозирования. Его можно усилить с помощью других найденных нами катализаторов. На рис.2 в качестве иллюстрации показаны каталитические эффекты фосфата и триполифосфата. При увеличении скорости гидролиза N2O3 (фактически - нитрозилирования воды) уменьшаются стационарные концентрации как N2O3 так и NO2 из-за сдвига равновесия в реакции (3).

Впрочем и здесь не обошлось без парадоксов и неожиданностей. Перфторуглеводороды и их гетероаналоги (вещества содержащие помимо C и F другие атомы; например перфтороктилбромид - ПФБ) близкие по растворяющей способности в отношении кислорода считались одинаково инертными. Поэтому при создании кровезаменителей выбор конкретных соединений был случайным и определялся в значительной степени давлением пара и доступностью в чистом виде. (В промышленности ПФУ и их гетероаналоги получают для далеких от медицины целей в частности для электротехники.) Так основу “Перфторана” составляет смесь изомеров перфтордекалина и перфтор-(4-циклогексил N-метил)пиперидина (рис.3). В Японии и США наиболее популярен перфтороктилбромид (C8F17Br ПФБ; в кровезаменителях “Перфлюброн” “Оксиджент” и др.).

Рис.3. Формулы перфторорганических соединений используемых в производстве кровезаменителей.

Интересно что сегодня перфтороктилбромид применяется при искусственной вентиляции легких. В легкие пациента (чаще в одно) вводят жидкий ПФБ (~1 л) и шланг с распылителем для подачи воздуха или кислорода. По завершении процедуры шланг удаляется а ПФБ остается в легких и медленно (недели-месяцы) выводится с выдыхаемым воздухом а часть его обнаруживается в крови.

Неоднократно отмечалось что физиологические свойства и кровезаменителей на основе перфторуглеводородов перфтороктилбромидов и чистых компонентов различны. Причины этого оставались непонятными. Действительно если бы эффекты этих соединений сводились лишь к транспорту кислорода они были бы одинаковы для всех ПФУ и ПФБ поскольку значения коэффициента распределения NO для перфтороктилбромидов и не содержащих атома брома перфторсоединений включая перфтордекалин (основной компонент “Перфторана”) также оказались близкими. Таким образом объяснить различные физиологические эффекты только разной сольватацией NO не удалось. В этой связи мы поставили под сомнение постулат об инертности перфтороктилбромидов in vivo и начали искать природные супернуклеофилы способные реагировать с ним при температуре тела [10].

Для перфторалкилгалогенидов были известны реакции перфторалкилирования при катализе низковалентными комплексами никеля и кобальта. Наиболее известная форма существования кобальта in vivo - кобаламин (витамин В12) который в восстановленной форме служит кофактором ряда ферментов (рис.4). Мы показали что кобаламин активирует ПФБ видимо с образованием перфтороктильного радикала и Co(II) который может снова восстанавливаться до Co(I). Значит витамин В12 в присутствии восстановителей играет роль катализатора перфторалкилирования под действием ПФБ. Реакцию удалось “визуализировать” с использованием флюоресцирующих мишеней. В тех же условиях связь C-F оказалась устойчивой: мы не обнаружили перфторалкилирования под действием перфтордекалина. Судьба гидрофобных перфторалкильных радикалов in vivo остается неизвестной. Вероятно они способны эффективно реагировать с NO (природным инактиватором свободных радикалов) образуя новые токсичные продукты.

Рис.4. Схема катализа кобаламином (витамином В12) реакций перфторалкилирования под действием перфторалкилгалогенидов. In vivo кобаламин восстанавливается до Со+1. Этот супернуклеофил способен “вырвать” атом брома из молекулы перфторалкилбромида (показана как CFBr). Образующийся перфторалкильный радикал CF· вступает в реакции с активированными двойными связями (показан замещенный акриламид Х - флюоресцирующая группа) ароматическими соединениями и др. Вновь образовавшиеся радикалы (2) стабилизируются различными путями приводя к стабильным CF-содержащим продуктам (3 4).

Принципиальное отличие ПФУ и ПФБ в отношении к супернуклеофилам типа восстановленных форм кобаламина позволяет объяснить различие свойств кровезаменителей на их основе: ПФБ в физиологических условиях нельзя считать химически инертным. Аналогичные объяснения применимы и к многочисленным отравлениям другими перфторалкилгалогенидами (ПФГ): помимо механизмов связанных с NO-катастрофами они могут участвовать в реакциях перфторалкилирования обычных метаболитов. Ясно что низкие концентрации кобаламина в тканях делают их малозаметными но не менее неприятными особенно при больших “периодах полувыведения” (мера времени жизни в организме) высших гомологов. Не исключено что в качестве восстановителей ПФГ помимо B12 могут выступать и другие метаболиты. Поскольку современный уровень знаний не позволяет оценить отдаленные последствия и степень риска эксперименты с использованием перфторалкилгалогенидов на людях следовало бы предельно ограничить.

Общее число пациентов получивших большие дозы перфтороктилбромидов по медицинским показаниям и добровольцев участников испытаний неизвестно но заведомо пятизначное. Низшие газообразные перфторалкилгалогениды используются как растворители в том числе при химической чистке одежды как фреоны (бромтрифторметан) а также в огнетушителях и автоматических противопожарных системах - от военной техники до космических кораблей многоразового использования (“Спейс Шаттл”). Описано множество случаев отравлений в том числе со смертельным исходом при вдыхании газообразных перфторалкилгалогенидов. Очевидно что и длительность воздействия и концентрации этих веществ (в частности в наших химчистках самообслуживания) могут меняться в широких пределах. Известны примеры когда серьезные проблемы со здоровьем и смерть наступали спустя значительное время после отравления ПФГ.

Открытие перфторалкилирования при катализе известным витамином после 40 лет работ по использованию ПФГ в медицине поднимает серьезные философские вопросы. Корреляция между появлением озоновых дыр и попаданием фреонов в атмосферу - факт установленный в ходе фундаментальных научных исследований. Реакция образования перфторалкильных радикалов при облучении фреонов ультрафиолетом попала не только в вузовские но и в школьные учебники. Связь алкилирования ДНК и свободно-радикальных реакций с мутациями и раком должен уметь объяснить любой выпускник средней школы. Аналогия между озоном и высокоактивными метаболитами участвующими в реакциях окисления (в том числе при биосинтезе NO) также кажется достаточно очевидной. Тем не менее тысячам добровольцев и пациентов вводили и продолжают вводить большие дозы ПФГ которые остаются в организме на месяцы. Остается загадкой почему и у участников и у организаторов таких экспериментов несмотря на все эти знания никогда не возникал вопрос о химической инертности ПФГ in vivo. Отрицательный ответ на этот вопрос мог и должен был быть получен много лет назад до начала массовых экспериментов на людях.

Сегодня острая необходимость в изучении биохимии ПФГ и методов детоксикации этих соединений и их потенциальных метаболитов очевидны поскольку несмотря на предупреждения экологов их по-прежнему широко используют в технике и в быту и случайные контакты с ними в случае разного рода аварий и форс-мажорных обстоятельств будут случаться и впредь даже при полном прекращении использования перфтороктилбромидов в медицине. Не исключено что эффективным методом выведения труднолетучих ПФГ и продуктов их превращений окажется кратковременное введение стабилизированных эмульсий химически инертных перфторуглеводородов (типа “Перфторана”) с последующим удалением их гемосорбцией вместе с “экстрагированными” перфторалкилгалогенидами.

* * *

В заключение мы хотим привести примеры популярных препаратов механизм действия которых связан с регуляцией метаболизма оксидов азота. Напомним что NO синтезируется из аргинина под действием NO-синтаз (NOS) и активирует гуанилатциклазу (GC) поставляющую цикло-ГМФ который и служит молекулярным сигналом к расширению сосудов (рис.5). Нитроглицерин и амилнитрит как искусственные доноры NO при сердечной недостаточности обеспечивают расширение сосудов миокарда и предотвращают развитие инфаркта. Более того они могут быть полезны даже на ранних стадиях после случившегося инфаркта или инсульта: помимо возобновления кровотока (благодаря активации гуанилатциклазы) образующийся NO действует как детоксикатор свободных радикалов концентрация которых резко возрастает после инфаркта или инсульта что и служит причиной гибели клеток сердечной мышцы или мозга. В последние годы в качестве эффективной экстренной меры пациента помещают в атмосферу с очень небольшим количеством NO.

Рис.5. Популярные фармацевтические препараты механизм действия которых связан с регуляцией метаболизма оксидов азота.

Развитие септического шока связано с чрезмерной активностью NO-синтазы индуцированной попавшими в кровоток патогенами. Организм пытаясь обезопасить себя от вторжения чужеродных клеток производит большие количества NO для их уничтожения. Это приводит к активации гуанилатциклазы слишком сильному расширению сосудов как следствие - к падению давления крови.

Страницы: 1 2