www.diplomrus ®
Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок
Содержание
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение...4
Глава 1. Литературный обзор...10
1.1. Промышленное цветоводство...10
1.2. Характеристика и вегетативное размножение декоративно-цветочных культур... 12
1.2.1. Бальзамин... 12
1.2.2. Бегония... 12
1.2.3. Хризантема...14
1.2.4. Петуния...17
1.2.5. Гиацинт...19
1.2.6. Рябчик...22
1.2.7. Сенполия...24
1.2.8. Лилия...28
1.3. Декоративно-цветочные культуры в условиях in vitro...33
1.3.1. Особенности создания технологии клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур...33
1.3.2. Трудности при клональном микроразмножении растений...35
1.3.3. Особенности культивирования декоративно-цветочных культур в условиях in vitro...41
Экспериментальная часть...56
Глава 2. Материалы и методы...56
2.1. Объекты исследований...,... 56
2.2. Техника культивирования in vitro...62
2.2.1. Изолирование и стерилизация первичных эксплантов...62
2.2.2. Регенерация декоративно-цветочных растений...63
2.2.3. Укоренение растений...64
2.2.4. Адаптация растений...64
2.3 .Условия культивирования...64
Глава 3. Особенности введения в культуру in vitro ...66
3.1. Изолирование и стерилизация первичных эксплантов...66
3.2. Использование растений-маточников отечественного и зарубежного производства для введения в культуру in vitro...68
3.3. Зависимость морфогенеза от полярного расположения первичных эксплантов на питательной среде...69
3.4. Первичная регенерация декоративно-цветочных растений...70
3.4.1. Луковичные культуры...70
3.4.2. Листовые культуры...80
3.4.3. Побеговые культуры...91
Заключение...94
Глава 4. Особенности микроразмножения и вторичной регенерации декоративно-цветочных культур in vitro...97
4.1. Луковичные культуры...97
4.2. Листовые культуры...104
4.3. Побеговые культуры...108
Заключение...112
4.4. Хранение и консервация некоторых культур...112
Глава 5. Укоренение in vitro и адаптация микрокультуры декоративно-цветочных растений к почвенным условиям...116
5.1. Укоренение микрокультуры в условиях in vitro... 116
5.1.1. Листовые культуры...116
5.1.2. Побеговые культуры...117
5.2. Адаптация микрокультуры к почвенным условиям ...118
5.2.1. Луковичные культуры...119
5.2.2. Листовые культуры...120
5.2.3. Побеговые культуры...121
Заключение...122
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ... 123
3
4
Экономическая справка...131
ВЫВОДЫ ...133
Список литературы...135
Приложение...142
Введение
Список сокращений
БАП - 6- бензиламинопурин
К — кинетин
ИУК - индолил-3-уксусная кислота
НУК - нафтилуксусная кислота
2,4 -Д - 2,4 -дихлорфеноксиуксусная кислота
АК - аскорбиновая кислота
Введение
За последние годы в России резко возрос ассортимент и спрос на многие цветочные и декоративные культуры. Реальная возможность обогатить рынок - воспользоваться достижениями и знаниями в области биотехнологии растений.
Одним из направлений биотехнологии растений является разработка и внедрение технологий клонального микроразмножения в производство -получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растению. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения: 1) получение генетически однородного материала; 2) освобождение растений от вирусов и грибных болезней, а также от паразитических организмов; 3) высокий коэффициент размножения (105-107 ед. - для травянистых, цветочных растений, 104-105 ед. -для кустарниковых древесных, 104 ед. - для хвойных в год); 4) сокращение продолжительности селекционного периода; 5) ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития; 6) размножение медленно растущих и плохо размножаемых традиционными способами растения; 7) возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания маточного посадочного материала.
Микроклональное размножение необходимо применять в случаях, когда: 1) не все виды, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (в основном древесные); 2) практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10-15 лет; 3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал ^ (накопление и
передачи инфекций, приводящих к гибели растений, наличие химерности и т.д.); 4) трудоемкость и сложность операций при размножении взрослых растений с помощью прививок; 5) неэффективность разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года; 6) высокий спрос на посадочный материал; 7) недостаточное количество исходного материала для массового размножения (дорогостоящие, плохо зимующие растения); 8) необходимость проведения селекционных работ; 9) сохранение и размножение исчезающих в природе видов; 10) омоложение материала (реювенилизация).
В настоящее время такие страны как Голландия, Дания, Бельгия, Польша, США и др. широко применяют данный метод для размножения декоративных, цветочных, кустарниковых и других видов растений.
Ы
Актуальность темы
В связи с возрастающим интересом и спросом в России на новые растения и развитием внутреннего и внешнего озеленения строений, а также необходимостью сокращения импорта посадочного материала низкого качества становится актуальной проблема массового размножения однолетних и многолетних декоративно-цветочных культур. Наличие инфекционного фона у посадочного материала сказывается не только на качестве цветения, внешнем виде и продолжительности жизни растений, но и на заражение окружающей среды опасными патогенами, что оказывает отрицательное влияние на экологию данного участка.
Эта проблема может быть успешно решена методом клонального микроразмножения, который используется не только в коммерческих целях, но и для выявления общих закономерностей морфогенеза растений, их особенностей и проявления в условиях iv vitro.
Декоративно-цветочные культуры относятся к различным, как правило, отдаленным друг от друга ботаническим таксонам, значительно
отличающихся уровнем тотипотентности клеток и регенерационным потенциалом, что вызывает необходимость дифференцированного подхода к применению и совершенствованию технологий клонального микроразмножения. При оптимизации таких технологий массового производства растений важно обеспечить их экономическую эффективность за счет снижения затрат на химические реактивы, удешевления питательных сред и повышения адаптационной способности пробирочных растений к условиям in vivo при увеличении выхода и качества конечной продукции.
В настоящее время такие страны как Голландия, Дания, Бельгия, Польша, США и др. широко применяют данный метод для размножения декоративных, цветочных, кустарниковых и других видов растений. Однако сведения в литературе по вопросу клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур противоречивы или технологии приведены не полностью. В связи с этим изучаемая проблема является актуальной и практически значимой.
Цель и задачи исследований
Целью данной работы было разработать новые, усовершенствовать существующие и предложить универсальные технологии клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур в условиях in vitro.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- разработать методику введения в культуру in vitro различных типов эксплантов и изучить зависимость прямой регенерации от типа первичного экспланта;
- изучить рост и развитие пробирочных растений на разных этапах клонального микроразмножения;
- подобрать оптимальные питательные среды и условия культивирования эксплантов на разных этапах клонального микроразмножения;
изучить факторы гормональной и негормональной природы, влияющие на процессы ризогенеза;
- апробировать альтернативные питательные среды для замены среды Мурасиге-Скуга для хризантем и сенполий;
- разработать эффективные способы адаптации пробирочных растений к почвенным условиям;
- провести сравнительную экономическую оценку применения вегетативного и клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур.
Научная новизна
Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro групп декоративно-цветочных культур: луковичных (гиацинт, лилия, рябчик), побеговых (хризантема, бальзамин) и листовых (сенполия, петуния, бегония); разработана универсальная технология клонального микроразмножения на основе прямой регенерации растений из первичного экспланта, обеспечивающая сохранение морфофизиологических и хозяйственно-ценных признаков растений-доноров.
Впервые на исследуемых сортах хризантемы и гиацинта показана возможность их размножения в культуре in vitro с использованием в качестве первичного экспланта листовых пластинок. Эта технология позволяет многократно увеличить коэффициент размножения и сохранить целостность маточных растений.
Впервые для хризантем и сенполий испытаны комплексные минеральные смеси питательных сред, применение которых позволяет сократить время на их приготовление и снизить стоимость в 8 раз, а также проводить консервацию растений до 6-8 месяцев без пересадки при сохранении стандартных условий культивирования.
Разработаны новые технологии клонального микроразмножения декоративно-цветочных растений, предусматривающие сокращение технологического цикла в культуре in vitro с трех этапов до двух (за счет
исключения стадии укоренения на питательной среде), получать чистый посадочный материал на 1,5-2 месяца раньше и в 2-3 раза дешевле, чем при традиционной технологии.
Практическая ценность работы и реализация результатов исследований. Разработанные технологии предложены для практического применения в меристемных лабораториях (для фирм-производителей, совхозов и др. учреждений), использование которых позволит снизить затраты на производство рассады в 2-3 раза по сравнению с традиционными способами и обеспечить промышленное цветоводство элитным посадочным материалом.
Предлагаемые методики регенерации целых растений из изолированных соматических тканей могут быть применены в клеточной селекции и генной инженерии декоративно-цветочных растений на устойчивость к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды, при выведении новых сортов и восстановлении генотипического разнообразия флоры, а также в физиологических и генетических исследованиях.
Результаты экспериментальных исследований и теоретические обобщения работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов МСХА агрономических и биологических специальностей по курсу «Сельскохозяйственная биотехнология».
Апробация работы. Научные разработки экспонировались на различных выставках с 2001 года по 2004 год и были отмечены серебряной медалью ВВЦ (2001г.), в том числе на ежегодной Международной выставке «Цветы-2002» на ВВЦ, на ежегодной Всероссийской выставке «НТТМ-2004».
Результаты исследований были доложены на 2-й Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), на научной конференции, посвященной 160-летию со дня рождения К.А. Тимирязева (Москва, 2003); на конференции
«Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (22-25 марта 2004, Москва); на различных научных кружках (на каф. генетики МСХА, в клубе любителей комнатных растений), на заседаниях кафедры с/х биотехнологии МСХА.
10
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. ПРОМЫШЛЕННОЕ ЦВЕТОВОДСТВО
В промышленном цветоводстве во всем мире в настоящее время наиболее перспективным методом размножения цветов считается метод in vitro. Широкое использование технологии интенсивного размножения позволило Голландии стать крупнейшим производителем посадосного материала, а цветоводство - прибыльной областью хозяйства. Общий объем произведенной продукции цветочных луковиц Голландии равен 65% общего мирового производства луковиц, а общая продукция луковичных растений Голландии составляет 10.000.000.000 луковиц ежегодно (Табл. 1).
Использование технологий клонального микроразмножения позволяет сократить время выращивания до товарного стандарта для декоративно-лиственных бегоний и сенполий на 1-1,5 мес, для хризантем, лилий, гвоздик и орхидей - на 3-4 месяца (Митрофанова, 1992). Размножая какой-либо новейший сорт луковичных растений, можно вырастить несколько миллионов луковичек за один год, и, дорастив их в течение 2-3 лет, получить качественный посадочный материал. При обычных методах размножения для этого понадобилось бы около 20 лет (Черенок, 1997).
Таблица 1.1
Площади, занятые под производство луковиц цветов (IBC INFO 2001)
Название растений Площадь, 1998/99, га Площадь, 1999/00, га
тюльпаны 10.160 9.803
лилии 3.926 4.207
гладиолусы 1.677 1.756
нарциссы 1.784 1.818
гиацинты 1.121 1.115
ирисы 763 674
крокусы 680 657
георгины 463 463
другие 372 348
Общая площадь 20.995 20.841
п
Большинство декоративно-цветочного ассортимента массового производства выпускается с применением технологий клонального микроразмножения.
Так бельгийская фирма «Дероозе Плантс» является одной из самых перспективных в Европе и имеет не только селекционный центр, но и меристемный блок, а также дочерние предприятия в Голландии и США (штат Флорида). Ежегодно значительные средства инвестируются в селекцию и научные разработки. Фундаментальные исследования ведут по заказу этой фирмы три высших учебных заведения Фландрии («Цветоводство», 2001). Меристемная лаборатория фирмы «Дероозе Плантс» считается одной из лучших в Европе, которая ведет работы по клональному микроразмножению растений в селекционных и производственных целях. Через культуру in vitro прошло уже более 1000 видов и сортов горшечных растений, а ежегодный выпуск посадочного материала меристемного происхождения достиг 13 млн. штук при штате сотрудников 92 человека в данной лаборатории.
В России накоплен большой опыт по клональному микроразмножению важных для сельского хозяйства видов растений; практически во всех научно-исследовательских институтах, селекционных центрах созданы лаборатории биотехнологии, одна из главных задач которых оздоровление и микроклональное размножение ценного селекционного материала. Так, ВНИИ селекции плодовых культур (г. Орел) в биотехнологическую программу включено более 35 наименований декоративных и плодово-ягодных культур, что позволяет удовлетворить потребности населения региона в здоровом и ценном посадочном материале (Павловская, 1998).
12
1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА И ВЕГЕТАТИВНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ДЕКОРАТИВНО-ЦВЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
1.2.1. БАЛЬЗАМИН
Бальзамин, недотрога (Impatients Riv. et L.), сем. бальзаминовые. Род включает более 500 видов, распространен в Южной Европе, Юго-восточной Азии, Северной и Южной Африке, Северной Америке.
Однолетник или многолетник с мясистыми сочными листьями. Листья цельные или зубчатые. Цветки неправильные, одиночные или в пазушных кистевидных соцветиях различной окраски. Используют в рабатках, группах и как летнюю горшечную культуру, активно используется в последние 2-3 года в озеленении Москвы, при благоприятных условиях находится в стадии непрерывного цветения.
РАЗМНОЖЕНИЕ. Семена бальзаминов высевают в апреле в парнике, пикируют также в парник. В открытый грунт высаживают по окончании заморозков. Пересадку бальзамины переносят легко, а с влажным земляным комом их можно пересаживать даже во время цветения. Ценные генотипы бальзаминов черенкуют.
1.2.2. БЕГОНИЯ
Род бегония (Begonia L.) включает около 1000 видов и разновидностей, которые широко распространены в тропических и субтропических районах Центральной и Южной Америки, Азии и Африки.
Бегонии различаются характером роста: от кустовидных, высотой до 5 м, с одеревеневающими побегами до травянистых, почвопокровных, с ползучими, стелющимися и свисающими побегами. Листья разнообразны по форме, размеру и окраске: от простых, асимметричных или округлых, до сложных, состоящих из 5-10 листочков; от мелких (величиной с 1-копеечную монету) до крупных (размером с большой лопух). Края листьев цельные,
13
пильчатые, глубоко рассеченные, у некоторых видов украшены двойной или тройной бахромой. Окраска листьев так же разнообразна: от классических зеленых расцветок до темно-бордовых.
Цветки бегоний собраны в кистевидные пазушные соцветия, образующиеся на верхушках побегов. Околоцветник состоит из 2-5, у некоторых видов - из 6-8 лепестков. Окраска варьирует от ярко - красной до снежно-розовой, реже зеленоватая, желтая или оранжевая. Плод — крыловидная коробочка, семена мелкие - до 75 тысяч штук на 1 грамм.
Большинство бегоний успешно растут при комнатной температуре от 12 до 25° С и при относительной влажности воздуха не ниже 60%.
Пересаживают бегонии в марте - апреле в легкую рыхлую смесь из листовой земли, торфа и песка (2:1:1). Через месяц растения начинают подкармливать каждые 2 недели (Шахова, 1987).
РАЗМНОЖЕНИЕ. Декоративно-лиственные виды бегоний размножают преимущественно вегетативным способом (Жегулова, 1993). Для них основной метод размножения - укоренение черенков. Укореняют их в воде или субстрате (промытый песок, измельченный сфагнум или их смесь 1:1). Лист с маленькими надрезами, сделанными под разветвлениями крупных жилок, укладывают нижней поверхностью на субстрат. Вскоре в местах надрезов появляются корни, а затем и молодые растеньица. Размножение листовыми черенками лучше производить при повышенной температуре (28-30°С) весной и в начале лета (Курлович, 2001). Периодически через каждые 3-4 года взрослые растения перечеренковывают.
Семенное размножение бегоний. Цветки бегоний однополые и однодомные, располагаются в пазушных соцветиях. Цветоносы сложные, ветвящиеся. Мужские цветки раскрываются в соцветии на 6-10 дней раньше женских. Раздельнополость цветков препятствует самоопылению. Для получения семян в условиях культуры необходимо искусственное перекрестное опыление. Фертильность пыльцы неодинакова у различных
14
видов бегоний. Пыльцу при необходимости хранят в эксикаторе и при созревании женских цветков наносят мягкой кисточкой на рыльце пестика. Семена созревают через 20-25 дней.
Потенциальная семенная продуктивность видов очень высока и варьирует от 25560 семяпочек у В. quadrilocularis до 180750 у В. manicata. Реальная семенная продуктивность у сеянцев первого года жизни достигает 13-40 тыс. семян на особь. Семена бегоний очень мелкие и многочисленные, морфологически однотипные, но отличаются количественными показателями (масса, длина, ширина). Их всхожесть зависит от вида и времени сбора, обычно бегонии прорастают через 10 и более дней после посева. Лабораторная всхожесть при посеве свежесобранными семенами у всех видов составляет 80-100%, грунтовая всхожесть семян значительно ниже -27-61%.
Посевом семян размножают многие виды бегоний, например, бегонию вечноцветущую (В. Semperflorens). Семена высевают в феврале- марте, рассыпая по поверхности или присыпая тонким слоем земли 1 -2 мм Развитие проростков происходит однотипно у всех типов. Первый настоящий лист появляется через неделю и более от начала прорастания. В стадии развития 3-4-го листа на его поверхности проявляются первые видовые признаки (окраска, форма), затем по мере роста растения рассаживают в горшки. Продолжительность периода от появления всходов до цветения у различных видов варьирует от 95 до 190 дней (Шахова, 1987).
1.2.3. ХРИЗАНТЕМА
Хризантема (Chrysanthemum L.) — многолетнее растение из семейства сложноцветных (Asteraceae Dum.). Стебли прямостоячие высотой 25 — 120 см, иногда сильно разветвленные, на углубленной в почву части стебля развиваются столонообразные подземные побеги. Листья стеблевые, очередные, сильно варьируют по форме и рассеченности. Верхняя
15
поверхность листьев зеленая, редко опушенная, нижняя — тускло- или серовато-зеленая может быть с довольно обильным опушением. Соцветия хризантемы — корзинка. Цветки в корзинке неоднородны. По краю располагаются язычковые женские цветки, а в середине — трубчатые, обоеполые. В трубчатых цветках находятся 5 тычинок, которые срослись с венчиком. Соцветия различаются величиной, строением, формой и расположением цветков. Корневая система мочковатая (Дьяченко, 2004).
Хризантема — растение короткого дня: сокращение длины дня ускоряет развитие растений, вызывает закладку и формирование соцветий, поэтому их цветение начинается в августе и заканчивается в декабре. Высокорослые сорта используют на срезку, низкорослые — для горшечной культуры и высадки в открытый грунт.
РАЗМНОЖЕНИЕ. Хризантемы размножают вегетативно - черенкованием. Для получения черенков используют маточные растения, обладающие типичными сортовыми признаками (форма и величина соцветия, интенсивность окраски цветков и продуктивность). Их отбирают в период цветения. Осенью с них срезают всю надземную часть, так как старые стебли могут быть носителями вредителей и болезней, а удаление поросли способствует отрастанию весной большого числа побегов. Отобранные растения высаживают (по 40-50 шт./м2) в светлом вентилируемом помещении в пикировочные ящики высотой 12 см или горшки и хранят 4-6 недели при температуре 4-6°С. Для профилактики (от нематоды) перед посадкой корни очищают от субстрата и погружают в горячую воду (на 2 мин при 52°С или 5 мин при 45°С). Ранние сорта черенкуют с ноября до конца мая, средние - с марта до июня, поздние с марта до июля.
Как только на маточниках начинают отрастать побеги, температуру и влажность повышают. Кроме того, для постоянного роста и получения однородного посадочного материала в любое время года необходимо дополнительное облучение 14-16 часов при оптимальной освещенности
16
1000-2000 люксов (ртутные лампы ДРЛ-40). Досвечивание маточников в этот период увеличивает выход черенков до 70% и сокращает период укоренения на 7 дней.
Черенки срезают с побегов второго, третьего и четвертого порядка длиной 12-15 см, на которых 7-8 листьев. Основание черенка должно быть упругое, но не одревесневшее, что препятствует укоренению. Мягкие черенки, т.е. очень нежные, подвержены гниению. Верхняя часть побега, срезанная на черенок, должна быть длиной 6-8 см и иметь 3-4 листа. На срезанной части побега оставляют 2-3 листа, так как через 12-15 дней из пазух этих появляются побеги, которые также срезают на черенки.
Для реализации хризантем в горшках лучше использовать низкие растения позднего черенкования (апрель-май). Поздно размноженные декоративные и мелкоцветковые сорта образуют небольшой куст, поэтому их сажают по 3-5 шт. в горшки диаметром 11-15 см.
Срезанные черенки хранят в защищенных от испарения воды контейнерах при температуре 0-1 °С в течение 1-2 недель, а выращенные в хороших световых условиях и при высокой температуре (18-20°С), могут сохраняться до 3-8 недель в зависимости от сорта. Их укореняют на стеллажах, в ящиках, наполненных снизу слоем земли или торфа (5-6 см), затем (2-3 см) смесью песка и торфа в соотношении 2:1, высаживая на глубину 1-1,5 см по схеме 4x4 или 5x5. Быстрое укоренение хризантем происходит при температуре воздуха и почвы в пределах 16-18°С. Продолжительность периода укоренения в декабре- марте составляет 20-25 дней, в апреле- мае -12-15 дней; процент укоренения - 75-90%.
Количество черенков с маточника зависит от группы хризантем. Так, с крупноцветковых сортов получают от 8 до 22 черенков, с мелкоцветных - до 20-30 черенков в период черенкования.
?¦
Список литературы